一、参考标准

食品国标GB4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》

二、检验流程

单增李斯特氏菌计数有两种 *** ：MPN法和平板计数法。

（一）MPN法

1、样品稀释均质

无菌操作称取样品25g(mL),放入盛有225mL LB1的无菌均质袋内(或均质杯)内，振荡混匀,制成1∶10的样品匀液。

用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。

2、接种和培养

选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10mL LB1肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1mL(如果接种量需要超过1mL,则用双料LB1增菌液)于30℃1℃培养24h2h。每管各移取0.1mL,转种于10mL LB2增菌液内,于30℃1℃培养24h2h。如图1所示。

图1

用接种环从各管中移取1环,接种李斯特氏菌显色平板,36℃1℃培养24h-48h。菌落形态应为蓝绿色菌落，带白色晕环，如图2所示。自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选)。

图2

3、结果判定

根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g (mL)单核细胞增生李斯特氏菌的MPN值。

在10-1-10-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度 *** 如下：

a）有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的更高稀释度及其相连的两个更高稀释度（见示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下同）；

b）在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度（见示例c）；

如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度（见示例d）；

如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度（见表示例e）；

c）没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个更低稀释度（见示例f）；

如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的更高稀释度，进而确定三个连续稀释度（见示例g）。

举例说明：若单核细胞增生李斯特氏菌的阳性管数的示例为3-3-2-0-1，则选择的稀释度为3-2-1，根据MPN检索表所得样品中含有单核细胞增生李斯特氏菌为1500CFU/g（mL）。

（二）平板计数法

1、平板计数

样品均质，如MPN法均质，所用均质的稀释液为BPW或LB。

选取2个-3个适宜的连续稀释度,每个稀释度的样品匀液分别吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板上。倒置于培养箱,36℃1℃培养24h-48h。菌落形态应为蓝绿色菌落，带白色晕环。如图3所示。

图3

选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15CFU-150CFU之间的平板,计数典型菌落数。分以下6种情况：

①只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU-150CFU之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落；

②所有稀释度的平板菌落数均小于15CFU且有典型菌落,应计数更低稀释度平板上的典型菌落；

③某一稀释度的平板菌落数大于150CFU且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落；

④所有稀释度的平板菌落数大于150CFU且有典型菌落,应计数更高稀释度平板上的典型菌落；

⑤所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU-150CFU之间且有典型菌落,其中一部分小于15CFU或大于150CFU时,应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平板上的典型菌落；

⑥2个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU-150CFU之间按照公式二计算。

2、结果计算

公式一：T=AB/Cd

注：T：样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落。A：某一稀释度典型菌落的总数。B：某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数。C：某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数。d：稀释因子。

例如，稀释100倍之后，三个平板典型菌落为80个，取5个典型菌落做鉴定，3个为阳性菌。

公式一计算：T=803/（510-2）=4800CFU/g（mL）

公式二：T=（A1B1/C1+A2B2/C2）/1.1d

注：T：样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落。A1：低稀释度典型菌落的总数。B1：低稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数。C1：低稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数。A2：高稀释度典型菌落的总数。B2：高稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数。C2：高稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数。d：稀释因子（低稀释梯度）。

例如，稀释10倍之后，三个平板典型菌落为80个，取5个典型菌落均做鉴定，3个为阳性菌。稀释100倍之后，三个平板典型菌落为10个，取5个典型菌落做鉴定，2个为阳性菌。

公式二计算：T=（803/5+102/5）/（1.110-1）=473CFU/g（mL）

3、结果报告

报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以CFU/g(mL)表示；如T值为0,则以小于1乘以更低稀释倍数报告。